在液相系統(tǒng)分析過(guò)程中，有沒(méi)有遇到過(guò)色譜峰前延現(xiàn)象？
為什么有時(shí)候同一個(gè)樣品減小進(jìn)樣量色譜峰就變得很好看？
日常的分析工作中，我們通常將更多精力集中在流動(dòng)相和儀器方法的選擇上，卻忽視了樣品進(jìn)樣溶劑的重要性。
如果溶劑選擇不當(dāng)則會(huì)產(chǎn)生“溶劑效應(yīng)”，使我們?cè)诙ㄐ院投糠治鲋挟a(chǎn)生誤判，影響分析結(jié)果。
因此，了解“溶劑效應(yīng)”產(chǎn)生的原因及掌握避免“溶劑效應(yīng)”的基本方法對(duì)我們分析工作者是十分必要的。
今天就跟大家分享一下，液相分析過(guò)程中“溶劑效應(yīng)”的那些事兒~
PART 01：溶劑效應(yīng)是怎么回事兒？
>>>> 1.溶劑效應(yīng)的概念
通常情況下對(duì)于溶劑效應(yīng)理解為稀釋劑溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相時(shí)造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會(huì)造成峰分叉或拖尾的結(jié)果。但是這種概念不能解釋實(shí)踐中其他由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異?，F(xiàn)象，如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強(qiáng)度并不一定大于流動(dòng)相，但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。
鑒于許多由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異?，F(xiàn)象不能用目前的溶劑效應(yīng)進(jìn)行解釋?zhuān)P者認(rèn)為有必要將溶劑效應(yīng)的概念進(jìn)行重新闡述：溶劑效應(yīng)，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對(duì)色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴(yán)重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。
>>>> 2.溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生過(guò)程解析
第一階段：樣品剛被注入系統(tǒng)，進(jìn)入色譜柱后，流動(dòng)相氛圍中的目標(biāo)物以正常速度被洗脫。因強(qiáng)溶劑洗脫，移動(dòng)速度快，樣品在空間上開(kāi)始慢慢分裂。
第二階段：在一定時(shí)間內(nèi)，溶劑氛圍中的目標(biāo)物移動(dòng)始終快一些，前后兩部分距離擴(kuò)大。但移動(dòng)快的目標(biāo)物所處氛圍逐漸被流動(dòng)相稀釋(注：因?yàn)槿軇┖土鲃?dòng)相均不保留)，其移動(dòng)速度會(huì)逐漸降至正常流速。直到前面目標(biāo)物的氛圍完全被流動(dòng)相替代，前后兩部分的距離穩(wěn)定下來(lái)。因而，樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度差距越大，兩部分目標(biāo)物最終的距離拉得越大。
第三階段：所有目標(biāo)物在色譜柱中正常移動(dòng)，但分裂已不可逆轉(zhuǎn)。
經(jīng)過(guò)檢測(cè)器，同一目標(biāo)物給出了兩個(gè)色譜峰。其中進(jìn)柱前即擴(kuò)散進(jìn)入流動(dòng)相的那部分目標(biāo)物組成了后面的色譜峰，它的保留時(shí)間與目標(biāo)物的真實(shí)保留時(shí)間基本吻合。
簡(jiǎn)單概括，強(qiáng)洗脫溶劑不均衡地參與了目標(biāo)物的洗脫，使色譜峰保留時(shí)間整體提前，而樣品在柱前的不充分?jǐn)U散導(dǎo)致了峰形扭曲。這種影響輕則導(dǎo)致峰展寬，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致峰裂分，給定性定量帶來(lái)災(zāi)難。
PART 02：溶劑效應(yīng)為啥會(huì)發(fā)生！
>>>> 1.溶劑強(qiáng)度
在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序?yàn)樗ㄗ钊酰技状迹家译妫家掖迹妓臍溥秽急迹级燃淄椋ㄗ顝?qiáng)）。溶解樣品的溶劑強(qiáng)度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強(qiáng)度，樣品溶劑可以看成流動(dòng)相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會(huì)被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動(dòng)相，被流動(dòng)相洗脫出，這樣會(huì)造成色譜峰的展寬或者分叉。
>>>> 2.進(jìn)樣體積
當(dāng)進(jìn)樣體積較小時(shí)，擴(kuò)散至流動(dòng)相中的溶質(zhì)占大多數(shù)，且擴(kuò)散在很短時(shí)間內(nèi)完成，因此峰形與用流動(dòng)相直接溶解樣品無(wú)大差異。隨著進(jìn)樣的體積增大，留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大，當(dāng)進(jìn)樣體積增大到一定數(shù)量，留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現(xiàn)為色譜峰的分叉、拖尾等。
>>>> 3.溶劑與流動(dòng)相的兼容性
有時(shí)，當(dāng)我們使用流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機(jī)相無(wú)法直接溶解樣品，這時(shí)很多小伙伴會(huì)選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬(wàn)能溶劑”來(lái)溶解樣品。這樣進(jìn)樣的結(jié)果是溶劑與流動(dòng)相不兼容，溶質(zhì)難以在流動(dòng)相中擴(kuò)散。又如，在做參比制劑的溶出曲線中，溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進(jìn)樣后，由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數(shù)與在流動(dòng)相中的分配系數(shù)存在較大差異，就會(huì)導(dǎo)致峰形的問(wèn)題，甚至保留時(shí)間的漂移。
>>>> 4.電離狀態(tài)
電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動(dòng)相各自的pH差異引起。我們都知道，在反相體系中，目標(biāo)化合物的存在狀態(tài)不同，保留行為會(huì)有明顯的差異，而存在狀態(tài)就取決于目標(biāo)化合物在不同pH體系內(nèi)的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動(dòng)相中電離狀態(tài)差異較大，樣品溶液在接觸流動(dòng)相的過(guò)程中，來(lái)不及緩沖至流動(dòng)相中的電離狀態(tài)，這個(gè)時(shí)間如果較長(zhǎng)，就容易表現(xiàn)為保留時(shí)間發(fā)生錯(cuò)位或峰形變形，如下圖的案例。
（流動(dòng)相為pH 3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對(duì)照品，另外三個(gè)譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動(dòng)相）
>>>> 5.柱前管路
柱前管路內(nèi)徑越大、管路越長(zhǎng)，越利于目標(biāo)物向流動(dòng)相擴(kuò)散，而且使用更粗的管路比更長(zhǎng)的管路有效(注：假設(shè)死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬，對(duì)柱效有危害，然而相較于峰分叉的危害而言，前者尚能接受。
這就是為什么有時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn)，HPLC的液相（管路死體積大）比UPLC的液相（管路死體積?。┥V峰型好。
PART 03：有什么危害？
1.導(dǎo)致柱效下降，危害分離；
2.危害峰形，危害定量，甚至危害定性；比如，在LCMS中，掃描前體離子時(shí)，遇到這種情況，甚至不知道哪個(gè)峰才是目標(biāo)物；
3.當(dāng)標(biāo)樣和樣品的溶劑不一致時(shí)，保留時(shí)間不吻合，同樣危害定性；比如酒類(lèi)成分分析，標(biāo)樣溶于純水，樣品是過(guò)濾的酒，后者的溶劑就是乙醇水，它的保留時(shí)間必定早于純水溶解的標(biāo)樣；再比如水中污染物分析，目標(biāo)物溶于有機(jī)相得到標(biāo)樣，而樣品是過(guò)濾后的天然水；
4.強(qiáng)洗脫的溶劑在基質(zhì)中提取出的雜質(zhì)遇流動(dòng)相會(huì)析出，堵塞針座、柱前管路或色譜柱。
PART 04：應(yīng)該怎樣解決“它”？
1.溶劑強(qiáng)度
對(duì)于這一最普遍的溶劑效應(yīng)，解決辦法即調(diào)整稀釋劑或流動(dòng)相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低于流動(dòng)相都是可以的。一般情況下，為避免溶劑強(qiáng)度差異導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)，反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機(jī)相比例和流動(dòng)相相當(dāng)，必要時(shí)可略高于流動(dòng)相，但應(yīng)當(dāng)據(jù)其評(píng)估其溶劑效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。
2.進(jìn)樣體積
常規(guī)情況下，為了保證峰形，我們的進(jìn)樣體積都控制在5-20μL，盡量不要超過(guò)25μL。如果不能做到減少至合適的進(jìn)樣體積，為了得到較好的峰形，應(yīng)盡量選擇與流動(dòng)相比例相同或接近的溶劑。
3.溶劑與流動(dòng)相的兼容性
使得溶劑與流動(dòng)相能較好地兼容，目前辦法有兩個(gè)：
a.若流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機(jī)相無(wú)法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲(chǔ)備液，然后用流動(dòng)相稀釋至所需濃度；
b.在流動(dòng)相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑，或提高有機(jī)相的比例。
4.電離狀態(tài)
電離狀態(tài)的差異許多情況下會(huì)表現(xiàn)為保留時(shí)間的漂移或不穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^(guò)將樣品溶液的pH調(diào)節(jié)至與流動(dòng)相一致，或增大流動(dòng)相的緩沖能力來(lái)改善。
5.柱前管路
對(duì)于梯度洗脫而言，在不影響分離度的情況下，可以改用較粗內(nèi)徑的柱前管路。(注意：若是等度洗脫，此方法會(huì)降低柱效；若是梯度洗脫，基本不影響柱效)。
以上便是液相色譜中“溶劑效應(yīng)”的全部?jī)?nèi)容。高效液相色譜進(jìn)樣前，必須選擇一種合適的溶劑體系，若溶劑選擇不當(dāng)會(huì)使得峰形發(fā)生不同程度的異常，進(jìn)而影響分析結(jié)果。
您學(xué)會(huì)了嗎？
